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2020-10
下呼吸道感染是临床最常见的感染性疾病之一， 具有很高的病死率。根据世界卫生组织 （ＷＨＯ）2018年公布的2016年统计数据，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在传染性疾病中位列第一，共导致约300万人死亡。
2002年非典型肺炎（SARS），2003年新型H1N1甲型流感，2013年H7N9流感病毒，以及2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情爆发，对人类的生命健康造成严重威胁。可见，呼吸道感染对人类健康的威胁有不断增加的趋势。
呼吸道感染病原早期诊断对于迅速有效控制急性呼吸道感染发挥着至关重要作用！
由于各种呼吸道病毒感染的临床症状相似，医生难以简单地通过体征做出病原学诊断。
为了及时控制病情，临床上常常采取经验性用药，待得到培养结果及药敏测试结果后再进行调整。但这也容易导致抗菌药物使用不当，使病原微生物耐药性出现及蔓延的概率增加，导致下呼吸道感染的诊断和治疗更为棘手，成为当今全球共同面临的重大卫生挑战。因此，开发新的、更准确及高通量的下呼吸道感染病原微生物检测方法具有重要意义。
近些年来，出现了改良细胞培养法分离并鉴定病毒，使其满足临床诊断的要求。不同的细胞种类对病毒敏感程度不同，接种未知标本就要选用多种不同的细胞系，工作量大，不利于临床实验室操作。因此出现了将不同种类的细胞混合起来制备成单层细胞的方法，可提高检测灵敏度。R-Mix是水貂肺细胞和A549的混合细胞，用来检测呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）、流感病毒及腺病毒（ADV）。而随着病毒特异性单克隆抗体的出现，可在产生CPE之前对病毒进行鉴定，缩短病毒检测的时间。这些方法虽经改良，但细胞培养操作耗时、敏感性低、技术要求高的问题未得到根本解决，因此在国内仍未能得到广泛应用。
直接免疫荧光法是目前临床最为常用的快速诊断方法之一。该方法使用荧光素标记的抗病毒单克隆抗体检测呼吸道上皮细胞中的病毒抗原，大约2h就能判断结果。但该方法的检测结果受样本的质量和处理过程影响较大，要求标本中有一定量的呼吸道上皮细胞，否则会造成假阴性的结果。
胶体金免疫层析法利用免疫层析的原理，通过抗原抗体结合，以胶体金为示踪物呈现颜色反应，从而判断样本中是否存在检测的抗原或抗体。该检测方法具有特异性强、操作简单、重复性好、方便快捷（一般能在10～30min获得结果）且不需要特殊设备和仪器等优点，因而非常适合临床早期诊断和出入境等机构的现场筛查，但是其敏感性低于实时荧光定量聚合酶链反应（Realtime RT-PCR），该检测方法的结果仅能作为初步参考。
呼吸道病毒感染是临床最常见的疾病之 一，病原学复杂，准确的病原学诊断是合理选择治疗方案的基础。
核酸检测法是检测病毒保守特异的核酸序列，可将病毒鉴定到种。临床实验室中应用最广泛的是PCR技术，利用互补引物特异性指数扩增病毒基因组中的片段。基于PCR技术及其衍生的荧光PCR和多重PCR技术，对病毒核酸检测灵敏度和特异性均较高（比传统病毒培养方法敏感3.8倍左右），但实验条件要求严格，单次检测种类有限，且成本较高。另外，有些病毒一旦感染后就会永久寄生在宿主体内，病毒核酸检测过于敏感，即使扩增结果阳性未必代表患者处在某种病毒的急性感染期。
病原微生物宏基因组检测法（mNGS）
宏基因组学（Metagenomics）也叫微生物环境基因组学。通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。
宏基因组二代测序，英文为“Metagenomics Next Generation Sequencing”,即mNGS，利用高通量测序，对样本中的核酸进行测序，可一次并行获取标本中的人源核酸序列信息和外源病原微生物核酸序列信息，将获得的序列与人类基因组序列库和病原体微生物基因组序列库进行比对注释，即可实现病原微生物的鉴定。
宏基因组检测覆盖已知的所有病原，对感染标本直接进行检测，无需预设，直接检测。包括细菌、真菌、病毒、寄生虫，以及支原体等，都可以“一网打尽”，为临床中呼吸道感染提供快速精准诊断依据。
宏基因组测序和传统检测方法学在病原检测方面的时效性比较示意图：
（病毒在多种方法学中的检测中时效性的对比）
胶体金免疫层析法：第3-7天；流式细胞法：第1-10天；传统免疫荧光法：第1-10天；核酸检测法：第0.5-20天；血清IgM：第5天后；IgG检测法：第15天后；mNGS法：1-2天。
总结：
通过分析比较，传统的培养法虽然是检测下呼吸道感染病原体的“金标准”，但通常需要2-4ｄ甚至更长时间。抗原方法检测结果对样本的质量要求高，否则容易造成假阴性的结果。血清学方法存在通量低，易出现假阳性结果等缺陷。核酸检测方法虽然是目前最快速的选择，但其单次检测种类有限。目前宏基因组病原体检测优势明显，具有快速检测、全面覆盖、准确性高等优势，适合于呼吸道感染的各个阶段，尤其是对早期诊断意义重大，已经逐步成为病毒诊断技术的发展趋势。
呼吸道感染临床早期诊断有利于避免抗生素的滥用，根据病原体的不同正确地进行抗病毒治疗；有利于降低院内传播风险；有利于开展个体化诊疗以降低患者整体治疗费用；并为早期预防和治疗提供病原学的有力支撑和实验室的明确诊断。
参考文献：
[1]郑凯文,黄晓园,陈渡波,张俊杰,王菊芳,徐鸿绪.基于多重PCR和第二代高通量测序技术快速检测下呼吸道感染病原微生物方法的建立和应用[J].国际检验医学杂志,2020,41(17):2066-2070.
[2]曹彬,刘振嘉.急性呼吸道病毒感染的诊断认识[J].诊断学理论与实践,2010,9(06):549-551.
[3] 陆小梅，黎四平，何月敬，等.呼吸道感染患儿1256例多种呼吸道病毒抗原检测结果分析[J].实用儿科临床杂志，2012.22(8):1733-1735.
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